基因编辑 “刹车系统”

CRISPR-Cas作为目前已广泛应用的基因编辑工具，但其持续表达可能带来由于脱靶导致的毒副作用。例如，Cas9可在非靶点位置引起大片段删除和染色质破碎[1]；Cas9切割双链DNA可引发p53介导的DNA损伤反应，抑制细胞生长[2]。最近的一项研究报道了通过 AAV 介导的 SaCas9 和 sgRNA 递送，将小鼠和非人类灵长类动物感光细胞中的 CEP290 基因进行编辑。有趣的是，这项研究报告显示，在单次给药后长达 40 周的时间内，眼睛中的 SaCas9 依然表达强劲，然后基因编辑以在约 1 周左右时完成[3]；因此，在编辑完成后，Cas9 持续表达将带来不利结果。

2022年11月7日基于腺嘌呤碱基编辑器的Verve-101疗法被FDA暂停，尽管原因尚不清楚，其母公司Verve Therapeutics 受此影响公司市值大跌30%至13亿美金。2022年7月Beam Therapeutics基于胞嘧啶碱基编辑的BEAM-201疗法同样收到FDA关于暂停BEAM-201的IND申请, 在其临床搁置的正式信函中提及有关该疗法脱靶性的问题。Beam公司在回答完有关问题后，FDA于12 月 2 日宣布解除了BEAM-201的临床搁置，并批准了其IND申请。上述结果提示在基因编辑完成后，应抑制CRISPR系统活性，以避免脱靶和毒性作用。基于 CRISPR 的疗法已进入临床试验，但尚未有在临床中证明抑制 Cas 酶的方法。针对 CRISPR 的基因编辑的抑制药物应被视为为许多 CRISPR-Cas 疗法建立安全标准的关键步骤。CRISPR抑制剂可以作为故障保险或辅助剂来减少患者基因编辑后的脱靶效应。目前，蛋白、小分子和核酸药物已被证明具有抑制CRISPR活性潜力(图一)，为实现CRISPR精准靶向奠定了基础。

图一、不同CRISPR抑制剂比较[4]

1. Anti-CRISPR蛋白

CRISPR 系统根据其基因组成和作用机制可分为：（1）1 类系统（包括 I、III 和 IV 型）由多亚基效应复合物组成，（2）2 类系统（包括 II、V 和 VI 型）包括单亚基效应蛋白[5]。目前常用的DNA或RNA编辑器,如Cas9, Cas12和Cas13则分属第2类系统中的类型II、V和VI型。抗 CRISPR (Acr) 蛋白由噬菌体编码用以逃避细菌和古细菌内的CRISPR 系统，目前已有超过50多种Arc蛋白被发现，它们之间在分子大小，序列结构等方面差异较大[6]。不同Arc蛋白可分别作用于不同CRISPR 系统亚型，目前发现Arc可针对5 个 CRISPR-Cas 亚型，包括 2 类 II、V 和 VI 型以及 1 类 I 和 III 型，迄今为止尚未报告 IV 型（图二）。另外存在不同的Arc靶向同一类型CRISPR系统，例如AcrIIA2 和 AcrIIA4抑制SpCas9, AcrVA1和AcrVA5 等抑制Cas12a [7, 8]。

图二、Arc蛋白类型[8]

Arc蛋白可通过抑制CRISPR-Cas与靶标DNA结合，抑制CRISPR-Cas切割活性，或抑制CRISPR-Cas复合物形成等不同机制抑制CRISPR 系统活性（图三）[7-9]。尽管大多数 Acrs 通过非酶促机制发挥作用，但仍有某些Acrs可通过酶促反应发挥抑制功能，例如AcrVA1 可促进crRNA 剪切[10]，AcrVA5可促进Cas12a 653位赖氨酸乙酰化，使Cas12a从靶标DNA脱落[11]。

体外实验表明Arc对Cas蛋白抑制浓度为nM级别，Bondy-Denomy课题组在体实验表明Arc如AcrIIA4可将CRISPR-Cas9的脱靶效应降低4倍以上，但不会显著降低在靶编辑[12]。Bondy-Denomy于2019年创立Acrigen Biosciences公司，通过Arc蛋白实现对基因编辑的精准调控。另外，由于Arc蛋白无法穿过细胞膜，因此其需要载体（如AAV病毒）进行递送。

图三、Arc工作原理

2. 靶向小分子抑制剂

2019年，Amit Choudhary组通过基于荧光偏振技术的高通量筛选和细胞水平测定方法鉴定出首个Cas9抑制小分子-BRD0539，进一步实验验证发现BRD0539可抑制SpCas9 和 PAM 序列之间的相互作用。尽管BRD0539可抑制Cas9对靶序列的切割，但其活性偏低且该化合物合成难度较大，因此难以推广使用[13]。2022年该课题组通过对该筛选系统进一步优化构建出基于荧光偏振累积活性测定（CAA）的新方法，通过该系统可筛选出抑制Cas9切割活性的抑制剂，而2019年该课题仅针对SpCas9与PAM位点结合过程进行筛选，系统缺乏普适性。通过CAA筛选，Amit Choudhar等发现小分子化合物BRD7586可抑制SpCas9活性，其可能通过阻止Cas9 HNH结构域和Helix结构域结合而发挥抑制功能。BRD7586抑制活性是BRD0539两倍以上，其作用于细胞在明显抑制Cas9活性的同时可显著提高基因编辑的特异性[14]。除此之外，与BRD0539需要8次化学合成相比，BRD7586可通过1次化学合成实现。因此BRD7586可作为先导化合物，合成更有效的Cas9抑制剂。由于CAA筛选具有光谱性，其也可应用于Cas12或Cas13抑制剂的发现。另外，该小分子抑制剂可进入细胞，其药物动力学与传统小分子药物类似。

3. 核酸类抑制剂

受到 Acr的发现和 Cas-sgRNA (RNP) 组装过程的启发，可以设计相应的核酸序列来破坏Cas RNP的组装过程，或抑制Cas RNP与靶序列的结合，从而达到抑制Crispr-Cas 活性的目的（图三）。2021年Keith T. Gagnon课题组通过理性设计了含有 NGG 序列（抗 PAM）的 DNA 发夹结构，或可与CRISPR sgRNA结合的2'-O-甲基修饰的寡核苷酸。上述核苷酸序列体外可达到nM级的抑制效率[15]。另外James Dahlman 教授及其团队通过将干扰sgRNA二级结构的寡核苷酸和靶向Cas9-mRNA的siRNA同时递送到小鼠体内，在降低CRISPR-Cas9肝脏中脱靶效应的同时，可提高其在肝外组织和器官(如脾和肺)基因组编辑的特异性[16]。由于已有核酸类药物如反义核苷酸（ASOs）和小干扰(siRNA)被FDA批准进入临床，因此通过核苷酸技术靶向CRISPR-Cas9的经验有迹可循。核酸类药物可通过修饰以提高其体内稳定性，另外其也可通过脂质纳米颗粒（LNP）包装的形式递送体内, 然而由于LNP大小（直径：~100nM）高于AAV病毒（直径：~25nM），只能在毛细血管大的器官如肝、脾、淋巴器官和骨髓等退出血液循环而进入靶器官[4]。

图四、核酸类抑制剂工作原理[4]

4. 抗CRISPR 肽段

2020年刘佳课题组发现首个能以变构方式抑制CRISPR-Cas9活性、来源于丝状噬菌体的天然多肽G8PPD，G8PPD大小为21个氨基酸，与Cas9 PAM结合结构域（PI）的K1158和K1176位点结合，远离Cas9 的sgRNA及DNA结合位点。体外切割实验表明G8PPD的IC50约为5mm, 高于Arc的作用浓度；但其大小远小于Arc蛋白（~50~200氨基酸）。另外由于G8PPD通过变构调节来实现对Cas9的抑制，因此G8PPD需在Cas9-sgRNA转入前提前加入。G8PPD可将Cas9的敲除效率降低1.4到4倍[17]。

5. Cas蛋白降解

Cas9蛋白融合一个或多个降解结构域后,通过加入相应的小分子可将Cas蛋白降解。通过Cas蛋白降解可能比单纯抑制其活性，对降低基因编辑过程中的脱靶效应更为有效。2017年，李晓江课题组通过将泛素化蛋白酶降解信号肽(RGKEQKLISEEDL)连接到Cas9的N端，可促进Cas9蛋白降解。在猴子胚胎应用含有该肽段的Cas9蛋白可缩短Cas9半衰期，并降低胚胎嵌合体突变的形成[18, 19]。2020年Jiing-KuanYee组通过将SMASh标签融合到Cas9蛋白中，由于在不添加抑制剂 asunaprevir（ASV）的情况下，活性蛋白酶NS3会将NS4A降解标签切割掉进而阻止Cas9蛋白降解, 而ASV(1mm)处理将导致Cas9降解，其半衰期为10小时左右；SMASh- Cas9融合蛋白在加入ASV后也可明显提供基因编辑的特异性[20]。另外将FKBP12F36V融合到Cas9后，利用Protac方法，利用小分子招募E3泛素连接酶CRBN，同样也可以起到降解Cas9蛋白的作用[21]。相似的，有研究将FCPF氨基酸插入到Cas9蛋白后，同样通过Protac方法，招募E3泛素连接酶CRBN，亦可有效降解Cas9 [22]。

由于目前基因编辑临床试验已在肿瘤，眼疾病，血液疾病和代谢疾病等开展，如何避免基因脱靶及寻找相关解决方法，已成为迫切需要。然而目前还未有相关抑制剂进入临床试验，基因编辑在人体中的应用仍有较大优化空间。

有问题请联系作者（[e-mail]）

参考文献：

1.Adikusuma, F., et al., Large deletions induced by Cas9 cleavage. 2018. 560(7717): p. E8-E9.

2.Haapaniemi, E., et al., CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. 2018. 24(7): p. 927-930.

3.Ruan, G.-X., et al., CRISPR/Cas9-mediated genome editing as a therapeutic approach for Leber congenital amaurosis 10. 2017. 25(2): p. 331-341.

4.Barkau, C.L., et al., Small nucleic acids and the path to the clinic for anti-CRISPR. 2021. 189: p. 114492.

5.Agarwal, N., R.J.P.i.M.B. Gupta, and T. Science, History, evolution and classification of CRISPR-Cas associated systems. 2021. 179: p. 11-76.

6.Shehreen, S., et al., Widespread repression of anti-CRISPR production by anti-CRISPR-associated proteins. 2022. 50(15): p. 8615-8625.

7.Marino, N.D., et al., Anti-CRISPR protein applications: natural brakes for CRISPR-Cas technologies. 2020. 17(5): p. 471-479.

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9.Chen, S., et al., Modulating CRISPR/Cas9 genome-editing activity by small molecules. 2021.

10.Zhang, H., et al., Structural basis for the inhibition of CRISPR-Cas12a by anti-CRISPR proteins. 2019. 25(6): p. 815-826. e4.

11.Dong, L., et al., An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. 2019. 26(4): p. 308-314.

12.Shin, J., et al., Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. 2017. 3(7): p. e1701620.

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15.Barkau, C.L., et al., Rationally designed anti-CRISPR nucleic acid inhibitors of CRISPR-Cas9. 2019. 29(3): p. 136-147.

16.Sago, C.D., et al., Augmented lipid-nanoparticle-mediated in vivo genome editing in the lungs and spleen by disrupting Cas9 activity in the liver. 2022. 6(2): p. 157-167.

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18.Tu, Z., et al., Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. 2017. 7(1): p. 1-11.

19.Yang, S., S. Li, and X.-J.J.C.r. Li, Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. 2018. 25(10): p. 2653-2659. e3.

20.Wu, Y., et al., A small molecule-controlled Cas9 repressible system. 2020. 19: p. 922-932.

21.Sreekanth, V., et al., Chemogenetic system demonstrates that Cas9 longevity impacts genome editing outcomes. 2020. 6(12): p. 2228-2237.

22.Gama-Brambila, R.A., et al., A chemical toolbox for labeling and degrading engineered cas proteins. 2021. 1(6): p. 777-785.

E.N.D

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